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Flashcards in Protein-Techniken Deck (30)
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1
Q

Was sind rekombinante Proteine?

A

Rekombinante Proteine sind biotechnologisch hergestellte Proteine, die in der Regek in einer Wirtszelle hergestellt werden

2
Q

In welchen Bereichen finden rekombinatne Proteine eine Anwendung?

A
  • Industrielle Nutzung (bsp. Waschmittel- und Lebensmittelindustrie)
  • Diagnostik
  • Therapeutische Nutzung
  • Wissenschaftliche Forschung
3
Q

Wie ist der grobe Ablauf für die Herstellung rekombinanter Proteine?

A
  1. Vermehrung der gewünschten DNA-Sequenz
  2. Klonierung in einen geeigneten Expressions-Vektor
  3. Transformation in den Zielorganismus
  4. Selektion transgener Organismen
  5. Kultivierung und Induktion der Expression
  6. Extraktion von Gesamt-Protein
  7. Aufreinigung des gewünschten Proteins
4
Q

Welche Arten von Expressionssytemen gibt es? Was sind je zwei Beispiele für ein solches Expressionssystem?

A
  • prokaryotische Systeme
    • E. coli
    • Bacillus spec.
  • eukaryotische Systeme
    • Hefen
    • Insektenzellen
5
Q

Was sind die Vor-/Nachteile eines prokaryotischen Systems als Expressionsvektor?

A

Vorteile:

  • einfache Handhabung
  • schnelles und kontrolliertes Wachstum
  • vielfälfig

Nachteile:

  • fremde Proteine akkumulieren häufig in “inclusion bodies” ( da sie in sehr großen Mengen exprimiert werden)
  • Falsche Faltung möglich
  • keine post-Translationalen modifikationen möglich
6
Q

Was sind die Vor-/Nachteile eines eukaryotischen Systems als Expressionsvektor?

A

Voteile:

  • Expression induzierbar
  • hohe Ausbeuten
  • einfach Handhabung bei Hefe

Nachteile;

  • Insektenzellen komplexer n der Handhabung
  • post-Translationale Modifikation in Hefen nur zum Teil möglich
  • Glykolisierungsmuster abweichend von anderen Systemen
7
Q

Was versteht man unter der Induzierbarkeit der Proteinexpression?

A

Die Gene werden hinter einen indzierbaren Promotor geschaltet. So lässt sich die Expression der Proteine regulieren.

8
Q

Was versthet man unter in vitro Experssionsystemen? Wann verwendet man sie?

A
  • Expression eines Gens findet nicht in einer Zelle sondern in einem Reaktionsgefäß statt
  • Alle notwendigen Bestandteile werden in das Reaktionsgefäß gegeben, sodass die Reaktion abläuft

⇒ Wird verwendet wenn sowohl proaryotische, als eukaryotische Expressionssyteme versagenw

9
Q

Welche Methoden des Zellaufschlusses für die Protein-Extraktion gibt es?

A
  • Potter
  • Mixer
  • Ultraschallbad
  • Kugelmühle
  • Frensch Press
10
Q

Was sind die notwendigen Schritte zur Herstellung von Protein-Roh-Extrakten?

A
  1. Zell-aufschluss
  2. Zell-Trümmer abzentrifugieren und Überstand abnehmen
  3. Proteingehalt bestimmen und Probe lagern (-20°C bis -80°C)
11
Q

Wie funktioniert die Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford?

A
  1. Bradford-Reagenz mit Proteinlösung mischen
  2. inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur
  3. photometrische Messung
  4. Konzentration anhand einer Protein-Eichgraden bestimmen
12
Q

Was ist eine SDS-Page? Wozu dient SDS?

A
  • Methode zum Auftrennen von Proteinen anhand ihrer Größe (Analog zur Gelelktrophorese von DNA)
  • SDS bindet an Polypetidketten und löst die tertiär und quartär Struktur von Proteinen auf
    • Außerdem: negativ geladene Kopfregion ermöglich Wanderung im elektrischen Feld des SDS-Page
13
Q

Aus welchen beiden Bereichen setzt sich das bei der SDS-Page verwendete Gel zusammen? Was ist deren Funktion?

A
  1. Sammelgel
    • Fokusiert “Proteinschmir” auf einer Bande
  2. Trenngel
    • Trennt untershciedlichen Proteine auf
14
Q

Durch welche beiden Stoffe können die Banden einer SDS-Page sichtbar gemacht werden? Wo liegt die jeweilige Nachweisgrenze?

A
  • Comassie(brilliant-blue)-Färbung
    • Nachweisgrenze bei 300 ng/Bande
  • Silbernitrat-Färbung
    • Nachweisgrenzene bei 10 ng/Bande
15
Q

Was ist das Prinzip einer 2D-Gelektrophorese?

A
  • Auftrennung nach der Größe der Proteine (vertikal) und ihrem isoelektischen Punkt (horizontal)
  • gibt erste Aufschlüsse über die Eigenschaften des Proteins
16
Q

Wie führt man eine 2D-Gelektrophorese statt?

A
  1. Proteinextrakt wird nach dem isoelektischen Punkt mittels eines pH-Gradientens
  2. Auftrennung nach Größe mittels einer SDS-Page
17
Q

Welche Möglichkeiten gibt es zur Aufreinigung von Proteinen?

A
  • Dialyse
  • Größenausschluss-Chromatographie
  • Affinitätsreinigung
18
Q

Wie funktioniert die Reinigung von durch Dialayse?

A
  • Zellrextrakt wird in einen Dialysebeutel gegeben und in in eine wässrige Lösung gegeben
  • Durch die semipermeable Membran des Dialysebeutels diffundieren Salze und kleinere Proteine aus diesem in die wässrige Lösung
19
Q

Wie funktioniert die Reinigung durch Größenausschluss-Chromatographie?

A
  • Lösung des Zellextraktes wird in eine mit einer Gelmatrix beladenen chromatographiesäule gegeben
  • kleine Proteinen verfangen sich in der Matrix und wandern daher langsamer

⇒ Auftrennung nach der Größe möglich

20
Q

Wie funktioniert die Reinigung von Proteinen durch Affinitätsreinigung am beispiel von his-tags?

A
  1. Im Expressionsvektor wird hinter die Sequenz des Gens ein Histidin-codierender Abschnitt gesetz → Exprimiertes Protein besitzt “Schwanz” von Histidin-Molekülen
  2. Zellextrakt wird auf eine Chromatographiesäuel geben, die mit einer MAtrix befüllt ist welche Wechselwirkungen mit Histidien eingehen
  3. Alle anderen Proteine durchlaufen die Säule ohne Wiederstand
  4. Abwaschen des Proteins von intersesse
21
Q

Was ist neben dem his-tag ein anderer weitverbreiteter tag für die Affinitätsreinigung?

A

Strep-tag II

22
Q

Welchen Nachteil können die tags haben? Was kann man dagegn tun?

A

Nachteil:

Tags können die Faltung/Konformaion des Proteins stören

Lösung:

Im Expressionsvektor zwischen Gen und Tag eine Sequenz einbauen, welche für eine Oligopeptidsequenz codiert die von spaltenden Enzymen als Erkennungssequenz erkannt wird

23
Q

Wofür verwendet man einen Western-blot?

A

Für den spezifischen Nachweis eines Proteins

24
Q

Welche zwei Methoden gibt es die Proteine von einer SDS-Page auf einen Membran für einen Western-blot zu übertragen?

A
  • wet
  • semi-dry
25
Q

Welche Stoffe verwendet man für den Nachweis von Proteinen?

A

Antikörper

26
Q

Welche zwei Arten von Antikörpern gibt es? Worin untersicheiden sie sich?

A
  • monoklonale Antikörper
    • Hochspezifisch → erkennen nur einen ganz bestimmten Teil eines Proteins
  • polyklonale Antikörper
    • Mischung aus mehren Antikörpern die jeweils verschiedene Teile ein und des selben Proteins erkennen
27
Q

Was sind die grundliegenden Möglichkeiten der Immunodetektion?

A
  • direkte Immunodetektion
    • Durch binden eines Antikörpers mit funktionellen Gruppen, die der Detektion dienen, an das Protein
  • indirekte Immunodetektion
    • Zur Detektion wird ein zweiter (sekundärer) Antikörper verwendet, für den der erste (primäre) Antikörper als Antigen dient
28
Q

Was sind die Vorteile der indirekten Immunodetektion?

A

Stark erhöhte Flexibilität durch Erkennung verschiedener primärer Antikörper durch den sekundären Antikörper

⇒ Reduzierung der Fehleranfälligkeit des Systems.

29
Q

Was ist ELISA?

A

Immunologisches Nachweisverfahren auf Basis einer enzymatischen Reaktion

30
Q

Wie funktioniert ELISA?

A
  1. Antikörper werden an eine Oberfläche fest gebunden
  2. Protein welches als Antigen fungiert wird hinzugegeben
  3. Ein Enzym-markierter Antikörper der an das Protein bindet wird hinzugegeben

https://youtu.be/lUWpWKVcmc4