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Flashcards in Transgene Organismen Deck (36)
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1
Q

Was versteht man unter einem transgenen Organismus?

A

“Gentechnisch verändert ist ein Organismus, dessen genetisches Material in einer Weise verändert worden ist, wie sie unter natürlichen Bedingungen durch Kreuzen oder natürliche Rekombination nicht vorkommt

2
Q

Was versteht man in der Gentechnik unter dem Begriff der Transformation?

A

Einbringen von genetischen Informationen in Organismen

3
Q

Was ist das Grundbrinzip der Transormation?

A

DNA → Vektor → Übertragungsweg → Zielorgan(ismus)

4
Q

Was für Arten der Transformation gibt es? Wie unterscheiden sie sich im Bezug auf die lokalisation, vererbung und Expression?

A
  • stabile Transformation
    • integration in das Genom des Empfängers
    • wird weiter vererbt
    • dauerhafte Expression, aber i.d.R nur eine Kopie
  • transiente Expression
    • Einbringen in Cytoplasma des Empfängers
    • nicht vererbt
    • nur für kurzen Zeitraum exprimiert, aber i.d.R Überexpression (→ viele Genkopien)
5
Q

Welche Methoden gibt es um eine stabile Transformation zu erreichen?

A
  • Integration durch nicht-homologe Rekombination
  • Integration durch homologe Rekombination
  • Partikelbombardierung und Rekombination (Pflanzen)
  • T-DNA vermittelte Transformation (Pflanzen)
6
Q

Bei der stabilen Transformation durch ____________________________ wird die Fremd-DNA an einer zufälligen Stelle im Genom des Empfängers eingebaut.

A

Bei der stabilen Transformation durch nicht-homologe Rekombination wird die Fremd-DNA an einer zufälligen Stelle im Genom eingebaut.

7
Q

Bei der stabilen Transformation durch ______________________ wird die Fremd-DNA gezielt an einer bestimmten stelle im Genom des Empfängers eingebaut.

A

Bei der stabilen Transformation durch homologe Rekombination wird die Fremd-DNA gezielt an einer bestimmten stelle im Genom des Empfängers eingebaut.

8
Q

Welche Methoden gibt es für die transiente Expression?

A
  • Transfer von Plasmid DNA in Zellkulturen
  • Agrobakterien (Pflanzen)
  • Partikelbombardierung (Pflanzen)
9
Q

Welches Bakterien taxon spielt eine wichtige Rolle in pflanzlichen Gentechnick? Warum?

A

Agrobakterien

⇒ besitzen ein Ti-Plasmid, welches einen Vektor zum stabilen transormieren von Pflanzen darstellt

10
Q

Welche Region des Ti-Plasmids ist entscheident für seine Funktion als Vektor? Wie ist diese aufgebaut? Wie kann sie für die Gentechnick nutzbar gemacht werden?

A

T-Region (transfer-Region)

  • T-Region besteht aus einer rechten und linken Grenze und der dazwischen ligenden T-DNA (transfer-DNA)
  • Wildtyp-DNA aus der T-Region kann ausgetauscht werden, solange die Grenzen der T-Region nicht verändert werden
11
Q

Was sind Nachteile an der T-DNA vermittelten transformation?

A
  • Agrobakterium kann (eigentlich) nur dikotyle Pflanzen infizieren → meisten Nutzpflanzen jedoch monokotyl
  • auschließlich nicht-homologer Einbau der T-DNA in Genom des Empfängers
12
Q

Wie erfolgt die T-DNA vermittelte Transformation von Pflanzenzellen?

A
  1. Austausch der Wildtyp-T-DNA mit modifizierter T-DNA
  2. Einbringen des Ti-Plasmids in Agrobakterien
  3. Infektion von Pflanzenzellen mit Agrobakterium
  4. Zellkultur von infizierten Pflanzenzellen präperirten Nährmedien für die Selektion der Zellkulturen
  5. Züchten einer transgene Pflanze aus Zellkulturen
13
Q

Wie ist modifizierte T-DNA aufgebaut?

A
  1. Linke Grenze
  2. Gen inkl. Promotor und Terminator
  3. Selektionsmarker
  4. Rechte Grenze
14
Q

Wie kann Arabidopsis leicht mittels T-DNA transformiert werden? Wie hoch ist etwa die Transformationsrate?

A
  1. Wenn die ersten Blüten blühen → “dipping” der Blüten in Agrobakterium-Lösung
  2. Kultivierung der Pflanze in Aufzuchtschrank (2-3 Wochen)
  3. Samen Reifung und Trocknung
  4. Selektion der transformierten Samen auf Nährmedium

⇒ Transformationsrate etwa 1%

15
Q

Wie ist die Ausgangssituation im “Postgenomics”-Zeitalter?

A

Zwar viele Genomsequenzen bekannt, aber ein Großteil der Funktionen von Genen ist unbekannt

16
Q

Wofür kann Transformation in der Pflanzenforschung angewandt werden? (beispielhaft)

A
  • Promotor-Reportergen-Fusion
  • Protein-Reportergen-Fusion
  • Struktut-Funktions-Untersuchung
  • Über-Expression von Genen
17
Q

Was versthet man unter der Promotor-Reportergen-Fusion? Wofür verwendet man sie?

A
  • Auf einen Promotor folgt nicht mehr das Gen welches er eigentlich reguliert, sondern ein Markergen
  • Gibt Aufschlüsse darüber, wo in einem Organismus ein Gen exprimiert wird
  • Das funktionelle Gen bleibt erhalten. Es wird nur eine zusätzliche Kopie hinzugefügt
18
Q

Was versteht man unter Protein-Reporterprotein-Fusion? wofür wird sie verwendet?

A
  • Anbringen eines flureszierendes Proteins an Gen
  • Gleiche verwendung wie bei Promotor-Reporterprotein-Fusion
19
Q

Was versteht man unter dem biolistic DNA transfer? Welche Art(en) der Transformation kann erreicht werden?

A
  • Fremd-DNA wird auf kleine Metallkugeln aus Gold / Wolfram gebracht und mittels einer Gen gun in Empfängerorganismen “geschossen”
  • Auf jeden fall transiente Transformation, mit geringer Wahrscheinlichkeit auch stabile
20
Q

Was ist der Vorteil/Nachteil an der Transformation von Plastiden?

A

Vorteile

  • Große Expressionsmengen
  • nur mütterlich vererbt → alle Tochterpflanzen auch transformiert
  • homologe Rekombination

Nachteil

  • Aufwendig zu selektieren auf Grund der hohen Anzahl an Plastiden
21
Q

Was versteht man unter “forward genetics”? Was ist bekannt/ unbekannt vor der Untersuchung?

A
  • Funktionsaufklärung von Genen und ihrer Produkte durch die Betrachtung vom Phänotyp zum Genotyp
  • Sequenz unbekannt
  • Funktion bekannt
22
Q

Was ist die Vorgehensweise der forward gentics?

A
  1. Isolierung einer interessanten Mutante
  2. Gezielte Kartierung und isolation es verantwortlichen Gens
23
Q

Was versteht man unter der “reverse Genetics”? Was ist bekannt/unbekannt zu Beginn der Untersuchung?

A
  • Funktionsaufklärung von Genen und ihrer Produkte durch die Betrachtung von Genotyp zum Phänotyp
  • Sequenz bekannt
  • Funktion unbekannt
24
Q

Was sind die zwei grundlegenden Möglichkeiten bei der reverse genetics?

A
  • gerichte Mutagenese ( gezielte Mutation eines Gens von Interesse)
  • zufällige Mutagenese (zufällige Mutationen von Genen)
25
Q

Wie ist die vorgehensweise der reverse genetics?

A
  1. Gen mutieren (oft mal knock-out des Gens)
  2. Untersuchung des Phänotyps
26
Q

Was sind Operationen der reverse genetics?

A
  • Rekombination
  • T-DNAinsertions-Mutagenese
  • Transponsible elements
  • CRISPR/Cas9
27
Q

Wie können Gene gezielt durch homologe-Rekombination in Hefe inaktiviert werden?

A
  1. Desing von Primern welche je eine homologe Sequenz für das Zielgen, als auch den Selektivenmarker haben
  2. PCR des Gens des Selektierbarenmarkers mit den vorher designten Primern
  3. Einbringen der Sequenz in Hefe
  4. Homologe Rekombination mit Zielgen in der Hefe → eine der beiden Genkopien verändert
  5. Bildung 4 haploider Sporen
  6. Selektion durch Selektierbarenmarker
28
Q

Wie könne Gene durch homologe Rekombination in höheren Eukaryoten (z.B Mäusen) ausgeschaltet werden?

A
  1. Blastocyten werden embryonische Stammzellen (ES) entnommen
  2. Target-Gen wird in die ES eingebracht
  3. ES in Zellkulturen vermehrt
  4. Selektion der Zellen bei denen der Einbau homolog stattgefunden hat (andere Karte)
  5. Diese Zellen in Blastocyt eines Wild-Typ-Organismus einbringen
  6. Einsetzen des Blastocyten in Mutter
29
Q

Wie können die embroytischen Stammzellen höherer Eukaryoten (z.B Mäuse) darauf hin selektiert werden, ob der Einbau des Target-Gens homolog/nicht-homolog stattgefunden hat? Wie ist hierfür das Repalcement-Konstrukt aufgebaut

A

Aufbau des Replacement-Konstrukts:

  • enthält zwei selektierbare Marker und die Sequenz des Gens welches ersetzt werden soll
  • eine der Ressistenzen innerhalb dieser Sequenz → Knock-out des Gens
  • anderer selektierbarer Marker hinter der Gensequenz

Ablauf der Selektion:

  • Nicht-homologe Rekombination:
    • Einbau des gesamten Replacement-Vektors im Genom der ES → beide Ressistenzen aktiv
  • homologe Rekombination:
    • nur der Teil des Replacement-Vektors wird eingebaut, welcher die Sequenz des Gens und des einen selektierbaren Markers besitzt → nur eine Ressitenz aktiv

⇒ Selektion möglich

30
Q

Wie können Transgene Mäuse durch zufällige integration von Fremd-DNA hergestellt werden?

A
  1. Injektion der Fremd-DNA in einen der beiden Pronuclei (männlicher/weiblicher Kern in einer Eizelle vor der Fusion)
  2. Einbringen der Zygote in Leihmutter
  3. 10-30% der Nachkommen tragen Fremd-DNA im Genom
  4. Züchten der Nachkommen
31
Q

Wofür verwendet man das Cre-Lox-System?

A
  • Herstellung Gewebe-spezifischer Knock-outs
  • Knock-outs nur zu bestimmten Zeiten in der Entwicklung
32
Q

Aus welchen Komponenten besteht das Cre-Lox-Sytem? Wozu dienen sie?

A
  1. LoxP-DNA-Sequenzen
    • flankieren/markieren das Zielgen in jeder Zelle des Organismus
  2. Cre-Rekombinase
    • entfernt den Bereich der DNA, welcher doch die Lox-Gene markiert wurde durch Rekombination
    • Ort der Expression der Cre-Rekombinase kann frei bestimmt werden → Gewebe-spezifische Knock-outs möglich
    • Stattdessen: Expression eines Reportergens
33
Q

Wie kann mit Hilfe von T-DNA die Funktion von Genen unteruscht werden?

A
  • T-DNA wird zufällig vor, in oder hinter einem Gen eingebaut
  • jenachdem wo sie eingebaut wird kann sie die Funktion/Expression verändern
34
Q

Was sind Transposons?

A

DNA Elemente die die Fähigkeit haben sich im Genom zu bewegen

35
Q

Wie könne Transposon-induzierte Mutanten Aufschluss über die Funktion von Genen geben?

A
  • Werden entweder vor, in oder hinter dem Zielgen eingebaut
  • je nachdme wo sie eingebaut werden kann sich die Funktion/Expression der Gene ändern
36
Q

Wieunterscheiden sich T-DNA-inuduzierte Mutanten von Transposon-induzierten Mutanten

A