Bioch : ADN Recombinant 1

Question 1

Principe d’obtention de l’ADN recombinant ?

Answer 1

• Organisme donneur : extraction d’un fragment d’ADN d’intérêt
• Le vecteur → sert à intégrer notre fragment d’intérêt
  → But = insérer le fragment d’ADN d’intérêt dans le vecteur pour obtenir un ADN recombinant

Question 2

Quelles sont les utilisation de l’ADN recombinant ?

Answer 2

• Amplification
• Purification des protéines d’intérêts
• Etude de l’expression et des fonctions des protéines correspondantes
• Localisation des protéines

Question 3

Définition de l’ADN recombinant ?

Answer 3

Combinaison entre l’ADN d’un organisme donneur et celui d’un vecteur

Question 4

Définition du génie génétique et technologie de l’ADN recombinant ?

Answer 4

Ensemble des techniques de construction d’un ADN recombinant et ses utilisations

Question 5

Définition du clonage ?

Answer 5

● Multiplication à l’identique à l’échelle cellulaire (clonage cellulaire) ou à l’échelle de l’organisme tout entier (clonage reproductif)
● Amplification d’un fragment d’ADN par des µ-organismes après son insertion dans un vecteur

Question 6

Définition d’un vecteur ?

Answer 6

Fragment d’ADN capable de réplication autonome

Question 7

Quels sont les différents vecteurs existant et la taille des fragments qui leurs sont associer ?

Answer 7

o Plasmide (fragments entre 0,1 et 10kb)
o Soit un phage (fragments entre 10 et 20kb)
o Cosmides (fragments de 50kb)
o YAC (gros fragments d’ADN de 500kb)

Question 8

Définition d’un plasmide ?

Answer 8

• Fragment d’ADN extra chromosomique,
  circulaire
• Présent dans les bactéries
• Susceptible de se répliquer de façon autonome
• Se comporte comme un chromosome accessoire

Question 9

Qu’est-ce qu’un YAC ?

Answer 9

Xsome artificiel des levures

Question 10

Quelle peut être l’origine de l’ADN de l’organisme donneur pour l’obtention de l’ADN recombinant ?

Answer 10

● ADN génomique (à partir d’une culture cellulaire…)
● ADN complémentaire (ADNc) → par transcription réverse sur des ARN messagers

Question 11

Intérêt de l’utilisation ADNc pour l’obtention d’ADN recombinant ?

Answer 11

• Plus stable que l’ARN
• Plus facile à utiliser dans les techniques de clonage de protéines recombinantes que ARN
• Ne contient pas les introns → épissés après la transcription de l’ARNm (versus ADN)

Question 12

Principe de la transcription réverse ?

Answer 12

1. Hybridation de la queue poly A avec un oligonucléotide complémentaire de la queue poly A → amorce faite d’oligo-dt (pour eucaryotes)
2. Élongation de l’amorce par la transcriptase reverse avec les d’NTPs → brin d’ADNc qui est synthétisé dans le sens 3’ → 5’
3. Deuxième brin d’ADNc → obtenue avec PCR réalisée sur l’ADN obtenu avec une ADN polymérase

Question 13

Qu’est-ce qu’une banque d’ADNc ?

Answer 13

clonage de tous les ADNc exprimés par une C à un moment donnée dans des conditions données

Question 14

Sur quoi repose la réverse transcription ?

Answer 14

Utilisation d’une enzyme → transcriptase reverse

Question 15

Déroulé de la réverse transcription ?

Answer 15

(cf schéma page 3)
1. Amorce oligo dT
2. Transcriptase reverse + dNTPs (5’→3’) => boucle en 3’
3. ARNm éliminé par digestion alcaline (soude/RNase H)
4. ADN polymérase I + dNTPs → synthèse 2ème brin 5’→3’
5. Nucléase S1 détruit la boucle en épingle à cheveux
==> ADN complémentaire 2ble brin que l’on peut cloner dans un vecteur plasmidique ou un phage

Question 16

Par quelle méthode se fait l’amplification du fragment d’ADN d’intérêt ?

Answer 16

PCR → Polymérase Chaine Reaction

Question 17

Définition de la PCR ?

Answer 17

Réaction de polymérisation en chaîne à partir d’amorces spécifiques de l’ADN d’intérêt, grâce à l’action de l’ADN polymérase dans un milieu contenant des nucléotides

Question 18

Quels sont les différents types de PCR ?

Answer 18

• PCR conventionnelle : qualitatif
• Cinétique de la PCR : quantitatif

Question 19

Axes de la courbe de la PCR classique ?

Answer 19

Nb de copies de l’ADN en fonction du nombre de cycles de PCR

Question 20

Définition des amorces ?

Answer 20

= séquences de nucléotides complémentaires de l’extrémité de la région à amplifier

Question 21

Déroulé de la PCR conventionnelle ?

Answer 21

1. Dénaturation à 95° : L’ADN double brin dénaturé pour avoir 2 ADN simple brin : Δ casse les liaisons hydrogènes entre les 2 brins
2. Hybridation : amorces vont s’hybrider, la T° d’hybridation (Tm) dépend de la séquence des amorces
3. Élongation : à 72°C avec la TAQ (thermophilus aquatiqus) polymérase uniquement dans le sens 5’→ 3’ pour obtenir 2 ADN double brin pour un cycle

Question 22

Quelles sont les différentes étapes de la PCR conventionnelle ?

Answer 22

● Extraction de l’ADN
● L’amplification de l’ADN avec la PCR
● Révélation par électrophorèse sur gel d’agarose (1-2%) : l’ADN est phosphorescent quand excité aux UV, s’il est chargé - il va migrer de la borne - vers la borne +

Question 23

Quelles sont les phase de la courbe de la cinétique de la PCR ?

Answer 23

4 phases :
→ amplification, non détectable au départ : phase de latence
→ phase exponentielle : on peut évaluer la quantité de copies d’ADN que l’on a
→ phase linéaire
→ phase de plateau, on n’aura pas plus de copies

Question 24

Différence entre la PCR classique en point final et en temps réel ?

Answer 24

• PCR classique en réaction en point final (= avec une phase de plateau vers la fin) est
  qualitative
• PCR en temps réel, est quantitative et très précise

Question 25

Quels sont les besoins de la TAQ polymérase pour fonctionner ?

Answer 25

l’ion Mg2+ pour fonctionner → ajout d'MgCl2 dans le milieu

Question 26

Calcul de la Température d’annealing : Tm ?

Answer 26

Tm = 2 x (A+T) + 4 x (G+C) +1°C pour les combinaisons GG, CC, GC - 1°C pour les combinaisons AA, TT, AT

Question 27

Caractéristiques du 1er cycle de PCR ?

Answer 27

* L'enzyme continue de fonctionner : ne s'arrête pas quand elle se trouve du côté des amorces qui sont en face → nucléotides qui se prolongent de chaque côté * Fin du 1er cycle = aucune molécule obtenue qui correspond au produit qu'on voulait → séq de part et d'autre ≠ de ce que l’on cherche * Nouveau cycle de PCR commence

Question 28

Caractéristiques du 2ème cycle de PCR ?

Answer 28

* Séq de part et d'autre de la séq qu'on veut amplifier * On obtient les complémentaires des brins obtenus lors du 1er cycle * Produits qu'on ne désirait pas, aucune ne représente le produit désiré * On lance un troisième cycle de PCR

Question 29

Caractéristiques du 3ème cycle de PCR ?

Answer 29

* 2 produits de PCR attendus apparaissent : doubles brins qui correspondent aux séq qu'on voulait spécifiquement * Ces produits vont se multiplier de façon exponentielle par rapport aux produits non souhaités

Question 30

Caractéristiques du 4ème cycle de PCR ?

Answer 30

* Les 2 molécules d'intérêt obtenues au 3ème cycle donnent chacune 2 molécules d'ADN d'intérêt * 4 fragments simple brin des autres molécules pourront donner un produit PCR souhaité * 8 fragments d’ADN * Au 5ème cycle, on aura 22 fragments d’intérêt etc... → Il faut au max 30 cycles pour avoir une amplification spécifique (min 20 cycles)

Question 31

Quelles sont les étapes qui compose chaque cycles de PCR ?

Answer 31

dénaturation, hybridation des amorces et élongation (la machine à PCR fait des cycles de T°)

Question 32

Quelles sont les ADN polymérases utilisée pour la PCR et pourquoi ?

Answer 32

* TAQ polymérase provient de Thermophilus aquaticus * PFU polymérase provenant de Pyrococcus furiosus : + spécifique, + fidèle que la TAQ, beaucoup + lente et + chère ==> L'ADN polymérase ne doit pas être dénaturée à 95°C : on utilise de l'ADN polymérase de bactéries thermophiles