Bioch : ADN recombinant 2

Question 1

Comment fonctionne la PCR en temps réel ?

Answer 1

• On obtient cycle par cycle la quantification en ADN
• Basée sur la détection d’un reporter fluorescent
• Signal obtenu est proportionnel à la quantité d’amplicons

Question 2

Précision de la PCR en temps réelle selon la phase ?

Answer 2

• Haute précision pendant la phase exponentielle
• Variabilité importante à la phase plateau

Question 3

Quelles sont les modalités (technique, matériel) utilisées pour les PCR classique et en temps réel ?

Answer 3

• PCR conventionnelle : sur gel d’agarose, qualitatif (visible à partir du 20ème cycle)
• PCR en temps réel : courbe de fluorescence, quantitatif

Question 4

Pourquoi faire la PCR en temps réel ?

Answer 4

→ Définir le seuil = niveau de fluorescence atteint au milieu de la phase exponentielle, représenté par une droite
→ Attribuer un cycle seuil (Ct) = base de la quantification.

Question 5

Qu’est-ce que le “cycle treshold” ?

Answer 5

CT = nb de cycles d’amplification nécessaire pour obtenir un signal fluorescent, statistiquement significatif par rapport au bruit de fond

Question 6

A quoi sert CT (cycle treshold) ?

Answer 6

Vraiment déterminer la quantité d’ADN produit lors de la PCR

Question 7

Que signifie la valeur du cycle treshold ?

Answer 7

+ Ct est petit, + l’échantillon est concentré
→ existe une relation linéaire entre la valeur du CT et le log du nombre de copies

Question 8

Importance du CT ?

Answer 8

• Ct = directement lié à la quantité d’ADN cible présent au début de la PCR → + le Ct est petit + la quantité d’ADN présente au départ est ↑
• Tous les calculs de quantification sont effectués à partir du Ct
• Plus le CT est petit, + l’échantillon est concentré en ADN et l’ADN a été détecté avant les autres

Question 9

Comment fonctionne la PCR en temps réel ?

Answer 9

• Appareil : thermocycleur + détecteur de la fluorescence
• Détection : fluorescence émise par un rapporteur → PCR classique mais on aura besoin d’une sonde en + des deux amorces

Question 10

Quelles sont les “chimies” utilisées pour la PCR en temps réel ?

Answer 10

• Chimie Sybr Green
• Chimie Taqman

Question 11

PCR avec la Chimie Taqman ?

Answer 11

= Sonde d’hybridation spécifique, oligonucléotide complémentaire : s’hybride en même tps que les amorces
* En 5’ → fluorochrome reporter
* En 3’ → quencher fluorescent → Fluorescent Resonance Energy Transfer au niveau de la manipulation

Question 12

Fonctionnement de la chimie Taqman ?

Answer 12

FRET possède un reporter (haute énergie) en 5’ + quencher (faible énergie) en 3’, (= fluorochromes)
1) début, pas de signal fluorescent émis par le reporter quand la sonde est intacte → quencher “inhibe”
2) sonde hydrolysée lors de l’étape d’élongation par l’activité 5’ 3’ nucléase de l’ADN polymérase → libère le reporter → on a une fluorescence
3) Quand polymérisation complétée → pour chaque molécule d’ADN synthétisée, un reporter émet de la fluorescence → fluorescence proportionnelle aux taux d’hydrolyse de la sonde hybridée donc à la quantité de produit d’amplification

Question 13

PCR avec la chimie Sybr Green ?

Answer 13

• Fluorochrome non spécifique → s’accroche sur ttes les séq d’ADN → sondes marquées
• “intercalant” fluorescent quand il est fixé à l’ADN, on mesure la fluorescence en fin d’élongation

Question 14

Fonctionnement de la chimie SYBR Green ?

Answer 14

• Avant amplification : sybr green émet peu de fluorescence, juste le bruit de fond
• Après amplification : sybr se fixe sur l’ADN double brin → émet une fluorescence donc ↑ du signal
• Emission de la fluorescence mesurée à la fin de chaque cycle d’élongation
• Fluorescence ↓ lorsque l’ADN est dénaturé à l’étape suivante

Question 15

Quelles sont les applications de la PCR en temps réel ?

Answer 15

• Quantification relative
• Quantification absolue
• Génotypage
• Quantification relative des transcrits

Question 16

Qu’est-ce que la quantification relative ? (PCR)

Answer 16

A partir d’ARN rétro-transcrit en ADNc par RT-PCR → niveau d’expression d’un gène par rapport à un gène de référence
* Ex :
- comparer C cancéreuses et C normales grâce aux taux d’expressions des C
- combien de fois il y a eu amplification ou diminution du gène qui nous intéresse
- rechercher des délétions

Question 17

Qu’est-ce que la quantification absolue ?

Answer 17

• Détecter des agents pathogènes, recherche d’OGM,
• Si abs d’amplification, on cherchera une diminution, etc…

Question 18

Qu’est-ce que le génotypage PCR ?

Answer 18

Analyse des polymorphismes (SNP) par discrimination allélique

Question 19

Objectif de la Quantification relative des transcrits ? (PCR)

Answer 19

Comparer l’expression des gènes dans différentes situations (cas normal + cas pathogène)

Question 20

Fonctionnement de la quantification relative des transcrits ?

Answer 20

On a :
* Gène cible = gène d’intérêt que l’on souhaite quantifier
* Gène de référence = exprimé de façon stable /!\ il a toujours le même Ct → normalisation de la quantité d’ARN ou d’ADN utilisée en RT-PCR
* Echantillon calibrateur = échantillon de référence (situation normale) → calcul par rapport à lui

Question 21

Calcul de la quantification relative ?

Answer 21

Quantification relative (△Ct) = calculer la différence de Ct du gène cible entre un échantillon X (celui qu’on étudie) et un échantillon calibrateur (échantillon de référence)

Question 22

Différence référence et calibrateur pour la quantification relative (PCR) ?

Answer 22

→ Référence : gène exprimé de façon stable c’est à dire 16S ou 18S
→ Calibrateur : c’est le point qui sert à comparer