T7_Diagnóstico Laboratorial em Microbiologia Clínica

Question 1

Marcha diagnóstica

Answer 1

1. • Fase pré analítica: amostra adequada e meio de transporte (se necessário);
2. • Fase analítica: processamento laboratorial e validação de resultados;
3. • Fase pós analítica: valorização clínica

Question 2

Fase Pré-analitica - Avaliação da amostra

Answer 2

• Local;
• Quantidade;
• Timing;
• Recipiente;
• Transporte;
• Preservação;

Question 3

Métodos de deteção

Answer 3

Pesquisa de:

a) Microorganismo: microscopia e exame cultural:
b) Ag/Ac: serologia;
c) Ácidos nucleicos: diagnóstico molecular;

Question 4

Exame cultural:

Answer 4

1. Observação macroscópica;
2. Exame microscópico direto: a fresco e corado;
3. Exame cultural;
4. Identificação e TSA

Question 5

Exame directo é a observação microscopica, que pode ser:

Answer 5

• Microscopia ótica:
  
  • De campo claro;
  • De campo escuro;
  • De contraste de fase;
• Microscopia de fluorescência;
• Microscopia eletrónica;

Question 6

O exame directo pode ser: Exame a fresco ou exame corado.

Exame a fresco pode ser feito como:

Answer 6

Permite observar (Amplicação de 400x)

• Células;
• Fungos;
• Parasitas;
• Mobilidade bacteriana;

Exame direto (sem manipulação), amostras liquidas

Pode adicionar-se um corante a amostra liquida:

1. KOH;
2. Azul de lactofenol;
3. Iodo;
4. Tinta da China;

Question 7

O exame directo pode ser: Exame a fresco ou exame corado.

Exame corado pode ser feito com:

Answer 7

• Gram (por excelência);
• Ziehl Neelsen (mycobacterium tuberculosis)

As amostras aqui não são liquidas,são fixadas

O exame corado permite a observação com maior amplicação que o exame a fresco (não corado) 1000x.

Só conseguimos caracterizar os MO em grandes ampliações e por isso corados. No exame a fresco permite vê-los ma não caracteriza-los, a não ser que sejam MO grandes como na figura em anexo.

Question 8

Exame corado pelo Gram tem quantos corantes?

Answer 8

Tem 2 corantes:

• 1º corante: violeta de cristal + Solução iodada: (agarra corante);
• Etanol: descoloração, que vai entrar nalgumas bacterias de parede frágil e remover o corante.
• 2º corante: safranina; As que perderam o primeiro corante vão corar pelo segundo corante.

Gram positivos ficam roxos;

Gram negativos ficam cor de rosa;

MÉTODO:

• I. Realização do esfregaço;
• II. Fixação por calor ou químico;
• III. Corar;

Permite observar:

• Células;
• Fungos;
• Parasitas;
• Morfologia bacteriana;

Question 9

Exame cultural

Answer 9

• Meios de cultura: sólido vs. líquido:
  
  • Não seletivos (ex: gelose sangue);
  • Seletivos (ex: CNA);
  • Seletivos e identificadores (ex: MacConkey;)
  • Especiais (ex: BCYE;)

(meio em tubo para crescer organismos de crescimento lento, ou bacterias altamente patologicas)

(Meio liquido para quando há urgencia nos resultados, como num caso de sepsis, já que as bactérias crescem mais rápido em meios liquidos)

Question 10

Identificação bacteriana

Answer 10

• Técnicas manuais;
• Técnicas automatizadas (18-24h):
  
  • Bioquímica;
  • Proteómica => + discriminação, demora 5 min;
  • Genómica;

Question 11

TSA

Answer 11

Teste de Sensibilidade aos Antibióticos;

Demora 24h (cultura) + 24h (TSA);

• Técnicas manuais: de difusão ou microdiluição;
• Técnicas automatizadas: de microdiluição ou deteção de genes de resistências;

Question 12

Cultura celular: prós e contras

Answer 12

Vantagens:

• TSA;
• Estudos epidemiológicos;
• Deteta simultaneamente vários organismos;
• Barato;

Desvantagens:

• Necessita microorganismo viável;
• Demorado;
• Negativo se houve antibioterapia prévia;
• Algumas bactérias não crescem em meios de cultura;

Question 13

Serologia

(Diagnóstico de fase de coalescência e não de fase aguda).

Answer 13

• Classicamente, deteção de Acs no soro;
• Também se podem detetar Ags no soro (ex: Legionella);
• Desvantagem: não há TSA;

Question 14

Genómica - Testes TAAN (Testes de amplificação de a´cidos nucleicos)

Answer 14

• Diagnóstico molecular;
• Rápido;
• Pode ser qualitativo ou quantitativo;
• Único ou para múltiplos microorganismos;
• Caro;
• Não precisa de microorganismo vivo;
• Pesquisa de ácidos nucleicos:
• Pesquesa de agente específico: pesquisa de gene da toxina A e B de C. difficile;
• Pesquisa de conjunto de organismos (abordagem sindromática): pesquisa dos agentes causadores de sépsis, infeções respiratórias, infeções GI, infeções do SNC, DSTs;
• Pesquisa de gene de resistência: deteção da resistência à isoniazida e rifampicina no MBT;

Question 15

Regras de segurança biológica

Answer 15

• Uso de bata obrigatório;
• Higiene das mãos;
• Unhas de gel prejudicam higiene;
• Cabelos compridos apanhados;
• Não ingerir alimentos;
• Não colocar objetos pessoais em cima da bancada de trabalho;

Question 16

Qual a técnica usada para realizar o exame cultural?

Answer 16

Técnica da sementeira por quadrantes

Question 17

Gelose simples

Answer 17

• Contém mistura de peptonas particularmente adaptada à cultura de microorganismos mais frequentes em amostras humanas;
• Pode tornar-se enriquecida pela adição de sangue, permitindo o crescimento de bactérias mais exigentes;
• Pode tornar-se seletiva pela adição de misturas antibióticas;

Question 18

Gelose sangue

Answer 18

• Isolamento de bactérias mais exigentes: gelose simples enriquecida com sangue de carneiro ou cavalo;
• Permite leitura da hemólise;

Question 19

Gelose chocolate

Answer 19

Isolamento de Haemophilus e Neisseria;

Gelose sangue aquecida para provocar hemólise dos eritrócitos, que assim libertam fatores intracelular essenciais para o crescimento do género Haemophilus: fator V (NAD). A placa fica de cor acastanhada => daí o nome

Question 20

Gelose chocolate-Haemophilus

Answer 20

• Isolamento seletivo de Haemophilus; Com base nutritiva enriquecida com fator X e fator V produzidos pela hemoglobina e pelo PolyViteX.
• Seletividade é obtida pela associaçção de bacitracina e vancomicina e anfotericina B, para inibir os restantes microorganismos que poderiam crescer

Question 21

Gelose MacConkey

Answer 21

• Isolamento seletivo e diferenciação de Enterobacteriaceae;
• Contém lactose, permite evidenciar a fermentação lática pela viragem para vermelho neutro (indicador de pH);
• Microorganismos que fermentam latose ficam rosas ou vermelhos;
• Os que não fermentam ficam incolores ou ligeiramente bege;
• Seletividade é proporcionada por sais biliares e cristal de violeta que impedem o crescimento das bactérias Gram positivas;

Question 22

Gelose SS

Answer 22

• Isolamento seletivo e diferenciação de Salmonella e Shigellla;
• Meio que evidencia colónias fermentadores de lactose e que reduzem tiosulfato por produção de H2S;
• Se fermentar lactose fica cor de rosa, se não fermentar fica incolor;
• Os microorganismos que produzem H2S originam colónias com centro negro; Inibição de crescimento de Gram positivas devido à presença de sais biliares e corantes;

Question 23

Gelose CLED

Answer 23

• Isolamento de microorganismos presentes na urina;
• Cistina, Lactose, Eletrólito Deficiente;
• Permite diferenciar lactofermentadores dos que não são: os que fermentam a lactose ficam com colónias amarelas ou amarelo esverdeado, e os que não fermentam lactose originam colónias verdes, azuis ou incolores;
• Impede swarming do Proteus: baixa concentração de eletrólitos

Question 24

Gelose Yersinia (CIN)

Answer 24

• Isolamento seletivo de Yersinia;
• Meio com manitol e vermelho neutro (indicador de pH), permite diferenciação de bactérias do genéro Yersinia;
• Presença de colato, desoxicolato, cristal violeta, Irgasan e antibióticos inibe crescimento de Gram positivas e da maioria das Gram negativas;
• CIN = cefsulodina, irgasan, novobiocina

Question 25

Gelose Campylosel

Answer 25

* Isolamento seletivo de Campylobacter; * Meio básico contendo sangue; * Seletividade conferida por mistura de antibióticos: cefoperazone, vancomicina, anfotericina B, que inibem a maioria das Gram positivas, negativas e leveduras

Question 26

Gelose Chapman (manitol salgado)

Answer 26

* Isolamento seletivo e diferenciação de Staphylococcus; * Meio com elevado teor de NaCl que limita crescimento de outros microorganismos; * Meio com manitol, sendo que os Staphylococcus fermentadores de manitol (S. aureus) ficam com colónias amarelas, e os não fermentadores originam colónias cor de rosa;

Question 27

Gelose BCYE-L

Answer 27

* Buffered Charcoal Yeast Extract L-cisteína; * Isolamento de Legionella; * Com L-cisteína (indispensável ao crescimento da bactéria), usado para sementeira de amostras com suspeita de Legionella; * Tem carvão ativado, que absorve elementos tóxicos presentes no extrato de levedura; * Tampão estabiliza pH do meio para crescimento da bactéria; * Podem-se adicionar antibióticos para inibir crescimento de elementos da flora saprófita;

Question 28

Gelose Sabouraud

Answer 28

Isolamento de fungos: leveduras e bolores

Question 29

Meio de Lowenstein-Jensen

Answer 29

Isolamento de micobactérias; Meio com enriquecimento pela presença de ovo, asparagina e fécula, que favorecem crescimento de micobactérias; Estado sólido do meio é conseguido por coagulação das proteínas do ovo; Tem indicador de pH: verde de Malaquite

Question 30

Meios líquidos de cultura

Answer 30

* Meio de Todd-Hewitt (enriquecimento de Streptococcus); * Meio de tioglicolato (enriquecimento de aeróbios, anaeróbios e microaerófilos); * Meio de selenito (enriquecimento de Salmonella); * Meio de tetrationato (enriquecimento de Salmonella); * Água de peptona alcalina (enriquecimento de Vibrio cholerae)

Question 31

Como funciona o Maldi-TOF MS?

Answer 31

Question 32

Todos os crescimentos bacterianos tem de ter uma validação laboratorial, ou seja, nem tudo o que cresce é necessariamente relevante. 2 Exemplos:

Answer 32

* **Exemplo 1:** Exsudado de ferida cirúrgica, colhido para exame cultural que revelou o crescimento de um Staphylococcus epidermidis. Sabemos que é uma bactéria frequente na nossa flora cutânea e também sabemos que não é uma bactéria piogénica e que só causa infeções em determinadas situações, nomeadamente quando há próteses ou matérias protésicos e etc. Então qual será a o resultado desta análise laboratorial? Apesar de ter havido o crescimento de uma bactéria, essa bactéria não é patogénica naquela situação, portanto o resultado é negativo. * **Exemplo 2:** A Brucella mellitensis é a responsável pela brucelose ou Febre de Malta. Quando detetada, independentemente de o individuo ter ou não sintomas, é para ser tratada. Portanto, nem sempre compete ao laboratório uma interpretação, mas na maior parte dos casos é preciso fazer uma interpretação

Question 33

Principais gram positivas e negativas encontradas ?​

Answer 33

Question 34

O que é e como se faz a titulação?

Answer 34

**Titulação:** determinar a maior diluição no soro que ainda consegue detetar a substância, sendo diferentes diluições do soro testadas com a mesma quantidade de Ag (reagente);

Question 35

O que é a seroconversão?

Answer 35

Seroconversão: subir 4x ou passar de negativo a positivo; Testar soro de fase aguda e da fase de convalescença: =\> exceção é resultado único na Legionella e HIV; Imaginando que um doente tem uma infeção, faz-se uma pesquisa de anticorpos e tenho título de b, tenho o valor de anticorpos na quantidade como está marcado em b. Se tiver só uma determinação não sei se este valor corresponde a uma fase em início ou em final, uma vez que o c tem a mesma concentração e representa uma doença já em recuperação. Então, em serologia faço sempre 2 determinações e aquilo que me faz o diagnóstico é a seroconversão, ou seja, os meus anticorpos passam de um valor negativo para um valor positivo.

Question 36

Compare os métodos de detecção quanto a: * Diagnóstico * Demora * Viabilidade * TSA * Epidemiologia * Custo

Answer 36

Question 37

O que são microrganismos problema e quais são?

Answer 37

É obrigatória a notificiação à DGS. São microorganismos que são isolados a partir de amostras invasivas (são só alguns em específico). Todos os laboratórios nacionais fazem um relatório destes microorganismos quando estes são isolados em amostras estéreis: hemoculturas e líquido cefalorraquidiano. * *Pseudomonas aeruginosa* * *Acinetobacter spp.* * *Enterobacteriaceae* * *Staphylococcus aureus* * *Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium* * *Streptococcus pneumoniae*

Question 38

O que são microrganismos "alerta" e quais são?

Answer 38

* São microorganismos que são particularmente perigosos no que toca à disseminação porque trazem consigo mecanismos de resistência que os tornam difíceis de tratar. * Comunicação obrigatória * *Staphylococcus aureus* com resistência à vancomicina (VRSA) * *Staphylococcus aureus* com resistência ao linezolide * *Staphylococcus aureus* com resistência à daptomicina * *Enterococcus faecium* e *Enterococcus faecalis* com resistência ao linezolide * *Enterobacteriaceae* com suscetibilidade intermédia ou resistência aos carbapenemes e\ou presumíveis produtoras de carbapenemases * *Pseudomonas aeruginosa* com resistência à colistina * *Acinetobacter spp.* com resistência à colistina